Библиотека

Многофункциональность лактоферрина: критический обзор.

Тезисы. Лактоферрин (ЛФ) – представитель семейства трансферринов, который экспрессируется эпителиальными клетками внутренних желез млекопитающих и, помимо этого, синтезируется и накапливается во вторичных гранулах нейтрофилов. Первоначально ЛФ рассматривался как железосвязывающий белок молока с бактериостатическими свойствами, но к настоящему времени получено много экспериментальных данных и доказательств, указывающих на то, что этот белок обладает множественными физиологическими свойствами. К этим свойствам относятся регуляция гомеостаза ионов железа, защита организма от широкого спектра микробных инфекций, противовоспалительная активность ЛФ, регуляция клеточного роста и дифференциация, а также ингибирование развития раковых заболеваний и метастазов. Хотя сродство ЛФ к ионам железа рассматривается как его основная биохимическая активность, биологическая аффинность этой молекулы к различным клеточным рецепторам организма и ряду специфических микробных компонентов указывает на многофункциональную природу этого белка. Мы обсуждаем в этой статье современное понимание свойств белковой молекулы ЛФ на клеточном и молекулярном уровне.

Введение. Лактоферрин (ЛФ) является 80 kDa железосвязывающим гликопротеином, который относится к семейству белков трансферринов (1). Трехмерная структура ЛФ была установлена кристаллографическим анализом с высоким разрешением и показала наличие двух гомологичных долей у этого глобулярного белка (2,3). Каждая из этих долей обратимо связывает один ион железа в присутствии ионов бикарбоната (1,4). Первичная экспрессия гена ЛФ наблюдается на стадии 2 - 4 клеток при раннем эмбриональном развитии млекопитающих и продолжается до окончания стадии формирования бластоциста. Дальнейшая экспрессия ЛФ прекращается вплоть до поздней стадии созревания плода, когда этот белок начинает синтезироваться в нейтрофильных клетках крови и эпителиальных клетках пищеварительного и дыхательного трактов (5). Во взрослом организме животного ген ЛФ экспрессируется эпителиальными клетками внутренних желез с последующей секрецией белка в слизистую и другие биологические жидкости. Наиболее высокий уровень ЛФ обнаруживается в молозиве и молоке, тогда как в слезной жидкости, слюне, кишечнике и репродуктивных тканях концентрация белка ЛФ значительно ниже (6,7). Кроме того, синтез ЛФ контролируется гормонами или ткань-специфическими транскрипционными факторами. Так, экспрессия этого белка в молочной железе контролируется гормоном пролактином, тогда как в репродуктивных тканях экспрессия ЛФ индуцируется эстрогеном (8). В кровеносной системе ЛФ синтезируется в созревающих нейтрофилах на миелоцитной стадии развития этих клеток и накапливается во вторичных гранулах этих же клеток (9-12). В настоящее время описано несколько биологических функций, которые проявляет ЛФ. Это гомеостаз железа, рост и дифференциация различных типов клеток, защита организма от микробных инфекций, а также антивоспалительная и противоопухолевая активности (7, 13, 14). Белок ЛФ относится к эволюционно консервативным биомолекулам, а его металло-хелатная активность ранее считалась одним из основных свойств. Тем не менее, ряд физиологических эффектов, которые проявляет ЛФ, включает в себя взаимодействие этого белка с другими клеточными компонентами. Это относится к бактериальным липополисахаридам (ЛПС) (15, 16), глюкозоаминокликанам (17), и специфическим клеточным рецепторами, которые локализованы на мембранах эпителиальных и иммунных клеток (13, 14, 18, 19). Разнообразие типов клеточных рецепторов, которые связываются с ЛФ, а также то, что для этих рецепторов известны другие лиганды, затрудняют дифференцирование специфической активности, которую проявляет только молекула ЛФ, как индивидуальный рецептор-связывающий агент. Это относится к рецептор-подобному липопротеину гепатоцитов (20), 136-кДа кишечному рецептору (21) и нуклеолину (22),. Тем не менее, современные исследования позволили установить, что белок ЛФ, взаимодейсвуя с клетками, вызывает модуляцию таких клеточных сигналов, как активацию митогенактивирующей протеинкиназы (МАР системы), регуляцию экспрессии определенных генов и ряда других (23-28). В ряде публикаций показано, что молекула ЛФ может проникать в клеточное ядро и непосредственно активировать экспрессию генов, хотя подобные наблюдения нуждаются в дальнейшем изучении и подтверждении (29-31).

Настоящий обзор описывает ряд функций ЛФ и молекулярных механизмов, которые использует этот белок для проявления своих разнообразных физиологических активностей.

Лактоферрин и гомеостаз железа в кишечнике.Физиологическая регуляция концентрации ионов железа в организме крайне важна, поскольку железо участвует во многих метаболических процессах. Избыток железа очень вреден и приводит к активации микробного роста, разрушению клеток под действием свободных радикалов. Первичная регуляция концентрации ионов железа осуществляется при абсорбционных процессах в тонком кишечнике где и осуществляется снабжение организма этим металлом в соответствии с его потребностями (32-34). Ранее считалось общепринятым, что ЛФ активно участвует в транспорте и переносе железа и это предположение было в течение долгого времени предметом ислледований и обсуждений (7, 35-37). Так, сильное сродство ЛФ к железу, а также повышенная концентрация этого белка в молоке, косвенно указывали на то, что ЛФ может играть важную роль в процессе абсорбции и усвоению железа в организме новорожденных (7, 36). Помимо этого, было установлено, что ЛФ является относительно устойчивым к протеолизу в пищеварительном тракте (38), а в тонком кишечнике были идентифицированы специфические ЛФ-рецепторы локализованные на поверхности энтероцитов (36). В экспериментах in vitro показано, что клеточная линия Сасо-2, которая содержит этот рецептор, более активно абсорбирует железо из комплекса ЛФ-железо (21), тем не менее, физиологическая роль этого рецептора in vivo остается неясной, и, скорее всего, может быть установлена в экспериментах с генетически-модифицированными мышами.

В настоящее время считается общепринятым, что основной механизм транспорта железа в кишечнике определяется системой ДМТ-1 (транспортер 1 двухвалентных металлов) (34, 39, 40), которая функционирует без участия молекулы ЛФ. Тогда справедливо предположить, что ЛФ, не являясь переносчиком железа в кишечнике, выполняет функцию связывания избытков ионов этого металла, которые могут находиться в слизистой кишечника (37). Это предположение нашло подтверждение в экспериментах, где показано, что новорожденные, принимающие ЛФ-содержащее грудное молоко, усваивали меньше железа, чем те, которые получали молоко без ЛФ (41). Дальнейшие исследования с использованием мышей с дефектом по гену ЛФ продемонстрировали, что этот белок действительно не используется для транспорта железа в организме новорожденных (42), более того, отсутствие ЛФ приводило к незначительному увеличению содержания железа в организме. Эти данные позволяют говорить о том, что ЛФ важен не для процессов метаболического переноса железа, а для связывания избытка ионов этого металла, что, в свою очередь, указывает на защитную функцию этого белка, контролирующего микробный патогенез и уменьшающий индуцированные свободным железом клеточные повреждения (37, 43, 44).

Роль ЛФ в защитных реакциях организма против микробной инфекции.

Преимущественная локализация ЛФ в секреторных выделениях косвенно указывала на то, что основная функция этой молекулы заключается в защите слизистой от экзопатогенов (37). В дальнейшем было установлено, что ЛФ, который синтезируется и накапливается нейтрофилами (11), эффективно используется в защите организма от энтеральных инфекций. Антимикробные свойства ЛФ изучены в in vitro и in vivo экспериментах (45-47). Показано, что способность этого белка подавлять широкий диапазон микробных агентов определяется несколькими молекулярными механизмами.

Одна из первых антибактериальных активностей, которая была экспериментально продемонстрирована для молекулы ЛФ – это его бактериостатическая активность. Высокая аффинность к железу, а также то, что ЛФ синтезируется и секретируется преимущественно в свободной от металла форме (апоформе), приводит к активному связыванию этим белков свободных ионов железа из окружающей среды, что замедляет рост микроорганизмов (7, 43, 48, 49).

В дальнейшем было установлено, что ЛФ обладает и прямой бактерицидной активностью против бактерий, независимо от его способности связывать железо (50). В экспериментах in vitro Ellison с коллегами в своей классической работе (51) показали, что бактерицидная активность ЛФ определяется его способностью связываться непосредственно с внешней мембраной Грам-негативных бактерий, что приводит к быстрому освобождению микробного липополисахарида и последующему разрушению мембраны, что вызывает гибель микроорганизма. Далее было высказано предположение, что именно положительно заряженный концевой домен молекулы ЛФ отвечает за бактерицидную активность этого белка. Этот домен, названный в дальнейшем лактоферрицин, был выделен из нативного белка и, при сравнительном анализе с интактным ЛФ, продемонстрировал более высокую активность против целого ряда Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий, а также вирусов, патогенных грибов, и простейших (52-53). Однако, как лактоферрицин может проявлять свои свойства в составе нативного полипептида ЛФ, и как он отщепляется от белка в месте локализации инфекции, остается пока невыясненным.

В последние годы были открыты ряд дополнительных биологических функций ЛФ, которые подтверждают его физиологическую значимость как антимикробного агента. Оригинальные исследования Singh с коллегами на примере Pseudomonas aeruginosa продемонстрировали, что комплексообразование ЛФ со свободным железом приводит к эффективному подавлению формирования бактериальной пленки (54). Было показано, что белок ЛФ ингибирует формирование биопленки, стимулируя особый тип движения микроворсинок на поверхности патогена P. aeruginosa. Это не позволяет бактерии прикрепиться к поверхности клеток хозяина с последующим формированием микроколоний. Надо отметить, что антипленочная активность ЛФ наблюдалась при крайне низкой концентрации ЛФ (0.02мг/мл), что в пять раз меньше, чем требуется для прямого ингибирования роста бактерий лактоферрином (54). Было установлено, что у больных с фиброзно-кистозной дегенерацией наблюдается повышенный протеолитический гидролиз и инактивация белка ЛФ, что приводит к хроническому заболеванию и формированию биопленки P. Aeruginosa в дыхательных путях (55). В экспериментах in vitro было получено подтверждение того, что именно протеолитическая деградация ЛФ приводила к потере его способности ингибировать образование биопленки микроорганизмами (56). Эти исследования указывают на то, что именно антипленочная активность ЛФ приводит к защите организма от инфекций, вызываемых P. Aeruginosa и другими микроорганизмами со схожей этиологией. ЛФ ингибирует сорбцию бактерии при непосредственном связывании с патогеном, или с мембраной клетки хозяина, что блокирует возможность связывания микроорганизма с клеточной поверхностью (57-59).

По близкому молекулярному механизму ЛФ защищает организм от ряда вирусных заболеваний. В этом случае ЛФ эффективно ингибирует начальные стадии вирусной инфекции, связываясь с вирусной частицей или с рецепторами клетки-хозяина, что экспериментально показано для ВИЧ, вируса гепатита С, вирусов герпеса 1 и 2, ЦМВ, ротавирусов, и респираторного синцитиального вируса (60-62).

Исследования последних лет позволили установить, что ЛФ может проявлять свои антимикробные свойства через свою протеолитическую активность, которая была обнаружена у этого белка сравнительно недавно. Эксперименты показывают, что ЛФ гидролизует и инактивирует микробные белки, которые играют ключевую роль при бактериальной колонизации энтеропатогеннойEscherichia coli, Shigella flexneri, и Haemophilus influenzae (63-66). Биохимическими методами установлено, что протеиназная активность ЛФ подавляется ингибиторами сериновых протеиназ, а каталитический центр, определяющий эту активность, располагается в N-концевом домене молекулы ЛФ (67). Физиологичекую актуальность этой ферментативной активности белка ЛФ для организма необходимо установить в in vivo экспериментах, но уже сейчас можно сказать, что консервативная природа протеолитического активного центра у молекулы ЛФ, который выделен из различных источников, указывает на то, что эта функция белка чрезвычайно важна (67).

Многочисленные эксперименты подтверждают то, что ЛФ может влиять на микробный патогенез не только при непосредственном взаимодействии с бактерией или клеткой -мишенью, но и через стимуляцию иммунной системы организма. Например, модуляция лактоферрином иммунного ответа через Т-хелперные клетки 1типа приводит к защите организма от инфекции St. Аureus у трансгенных мышей (68), а активация лактоферрином нормальных клеток-киллеров приводит к усилению прямого защитного эффекта этого белка против цитомегаловируса (69).

В заключении необходимо отметить, что, хотя ЛФ является мощным антимикробным агентом и играет ключевую роль в системе врожденного иммунитета организма, в некоторых случаях этот белок не может воспрепятствовать микробной инфекции. Было показано, что Str. Рneumoniae связывает и нейтрализует ЛФ через свой специальный мембранный белок А, что предохраняет эту бактерию от поражающего действия ЛФ (70), а такие микроорганизмы, как Mоxarella и Neissereaceae spp. могут отнимать и использовать железо из комплекса ЛФ-железо. Для этого эти бактерии используют специальные мембранные белки, которые являются специфическими рецепторами для ЛФ (71).

Противовоспалительные свойства ЛФ.

Как показано во многих публикациях, ЛФ, помимо прямого антимикробного действия, может влиять на воспалительный процесс, вызываемый микробной инфекцией. Это подтверждается экспериментами, в которых присутствие ЛФ защищает от гастритов, индуцируемых Helicobacter pylori (72), поддерживает целостность слизистой кишечника от воздействия бактериального липополисахарида (ЛПС) (73), снижает токсичность и уровень смертности при высоком инфицировании энтеротоксичным штаммом E. сoli. (74–76).

Опыты с клеточными линиями и эксперименты in vivo на животных позволили установить, что противовоспалительный эффект ЛФ определяется, прежде всего, тем, что этот белок ингибирует синтез ряда провоспалительных факторов включая тканевый некротический фактор альфа, интерлейкин-1, и интерлейкин-6 (TNF-a, IL-1, IL-6) (27, 77–79). Частично это обусловлено способностью ЛФ исключать из среды молекулярные индукторы Толл-рецептора, который и запускает механизм синтеза, так называемых, провоспалительных цитокинов (80). Доказательством этому является то, что белок ЛФ эффективно связывает такие индукторы, как ЛПС, растворимый фактор CD14, и неметилированную CpG бактериальную ДНК (16, 19, 81). Исследования с клеточной линией моноцитов показали возможность транспорта молекулы ЛФ в ядро с последующим ингибированием экспрессии генов провоспалительных факторов (27).

Помимо действия ЛФ на воспалительные процессы, которые индуцируются инфекциями, показано, что этот белок участвует в регуляции воспаления при нейродегенеративных заболеваниях (82-84), воспалительной кишечной болезни (85-87), кожной аллергии, легочных заболеваниях (88,89), и артритах (90,91). Более того, в экспериментальных моделях воспалительного процесса на животных добавление ЛФ приводит к ингибированию аллергической реакции. Например, ЛФ эффективно защищает против химического или IL-1 индуцированного острого воспаления животных и человека (92-95), химически индуцированного кишечного воспаления (96-98), воспаления пищеварительного тракта, вызываемого нестероидными лекарствами (99), и воспаления при ревматоидных артритах (100). Во многих случаях противовоспалительный эффект в этих экспериментах сопровождался снижением концентрации провоспалительных факторов и индукцией антивоспалительных цитокинов, например, интерлейкина-10.

Точный механизм действия ЛФ во время воспаления полностью не раскрыт, но способность этой биомолекулы связываться со специфическими рецепторами многих иммунных клеток, включая нейтрофилы (101), моноциты (102), макрофаги (103), и лимфоциты (104), а также с рецепторами эпителиальных клеток (13,21,105), указывает на возможность регуляции лактоферрином синтеза различных цитокинов через рецептор-зависимые метаболические сигналы. К другим противовоспалительным активностям ЛФ относят его возможность связывать железо в очаге воспаления (106), что приводит к уменьшению поражения клеток свободными радикалами и снижению аллергического астматического шока через дестабилизацию триптазы (107).

Защита против опухолевых заболеваний и развития метастазов.

Растущее число экспериментов на лабораторных животных показывают, что ЛФ эффективно защищает организм от химически индуцированного канцерогенеза, развития опухолей и метастазов в определенных органах включая пищевод, язык, легкие, печень, толстый кишечник, и мочевой пузырь (108-121). Более того, по всей вероятности, это противоопухолевое свойство ЛФ определяется, как и его антибактериальные активности, не одним, а несколькими молекулярными механизмами.

Первое предположение о возможной антиканцерной активности ЛФ было высказано после того, как было установлено, что в опухолевых клетках ген лактоферрина не экспрессируется или вообще отсутствует (122-127). В экспериментах с клетками человеческой грудной карциномы, а также на клеточных линиях, выделенных из опухоли шеи и головы, было показано, что ЛФ блокирует G1 и S стадии клеточного цикла раковой клетки. Этот ингибирующий эффект на клеточную пролиферацию определяется тем, что ЛФ индуцирует синтез белковых ингибиторов клеточного цикла р21 и р27 через митоген активирующий протеинкиназный путь (МАР) (23,128). Интересно, что ЛФ активирует синтез ракового супрессора р53 в карциномной HeLa клеточной линии (28). Исследования in vivo подтверждают результаты, полученные на клетках, и показывают, что ЛФ индуцирует процессы апоптоза в раковых клетках (129,130).

Иммуномодуляционные свойства ЛФ также необходимо учитывать при изучении противоопухолевой активности этого белка. В ряде экспериментов было показано, что ЛФ стимулирует пролиферацию и активацию таких иммунных клеток, как лимфоциты и нормальные клетки-киллеры (131-133), а с другой стороны, увеличивает чувствительность и доступность раковых клеток к атаке защитных клеток (134). В ранних работах Bezault с соавторами было установлено, что интраперитональная инъекция препарата, содержащего ЛФ, приводила к подавлению развития твердых опухолей и останавливала распространение метастазов в легких, тогда, как специфические нейтрализующие антитела к нормальным клеткам-киллерам полностью ингибировали этот защитный процесс (108). С другой стороны, антиканцерная активность ЛФ значительно выше у иммунокомпетентных животных, чем у иммунодефицитных (109). В современных работах было установлено, что ЛФ, помимо активации нормальных клеток-киллеров, усиливает активацию CD4+ и CD8+ лимфоцитов (110,113,121). Усиление системного иммунного ответа наблюдалось даже при пероральном введении ЛФ (110, 113, 120, 121).

Исследования механизма действия ЛФ против развития раковых клеток позволили установить, что важную роль в этом процессе играет интерлейкин-18, который является мощным активатором клеток иммунной системы (135). Экспрессия именно этого цитокина усиливается в присутствии ЛФ в клетках кишечного эпителия, а также происходит активация протеазы каспаза-1, которая необходима для ферментативного процессинга интерлейкина-18 (120,121,136). Считается, что именно секреция интелейкина-18 в кишечнике и крови играет центральную роль в координации системного и локального иммунного ответа (114,137). Механизм синтеза и активации интерлейкина-18/каспазы-1 возможен через связывание ЛФ с рецептором кишечной или локальной иммунной клетки с последующей передачей сигнала в ядро, но механизм передачи метаболического сигнала еще следует установить экспериментальным путем.

Помимо вышесказанного необходимо добавить, что ЛФ, как и интерлейкин-18, обладает антиангиогениновой активностью, которая в раковых клетках очень высока. Это было установлено в обоих in vitro и in vivo экспериментах (111,112,138).

Лактоферрин как регулятор морфогенеза.

Современные исследования новозеландских ученых позволили открыть новую активность ЛФ, которая позволяет рассматривать этот белок как регулятор морфогенеза костной ткани. При использовании смешанной культуры костных клеток было установлено, что ЛФ защищает кость от резорбции (139). В дальнейших исследованиях было показано, что ЛФ вызывает рост и развитие остеобластов и, одновременно, ингибирует процессы апоптоза этих клеток (140). Более того, ЛФ усиливает клеточную дифференциацию остеобластов и подавляет остеокластогенез. Результаты экспериментов позволяют отнести белок ЛФ к наиболее сильным активаторам роста кости по сравнению с уже известными факторами включая эпидермальный фактор роста. Очень важно, что этот анаболический эффект на костную ткань был подтвержден в экспериментах in vivo на мышах , которым ЛФ вводился подкожно (4 мг/день) в течение 5 дней, что привело к 4-х кратному увеличению костной массы животного по сравнению с контролем (140).

Более тонкие биохимические исследования позволили установить, что ЛФ связывается с рецептором клеток остеобластов – рецептор-подобным липопротеином 1 (ЛПР-1) (26). Такое взаимодействие приводит к активации протеинкиназного сигнального пути р42/р44, причем эндоцитоза ЛФ для проявления митогенной активности не требуется. Хотя физиологическая целесообразность этого открытия для сформировавшегося организма пока не ясна, использование ЛФ как терапевтического агента, например, при лечении остеопороза, выглядит очень перспективно (26).

Как показано в дальнейших работах, ЛФ обладает митогенной активностью по отношению к ряду других клеток, например, энтероцитам (141-144), В и Т лимфоцитам (104,145), макрофагам (146). Тем не менее, молекулярный механизм взаимодействия ЛФ с этими типами клетками не включает рецептор ЛПР-1 и активацию протеинкиназного сигнала для клеточной пролиферации.

Заключение и будущие перспективы.

Считается установленным фактом, что ЛФ является многофункциональным белком, который отвечает за ряд физиологических и патологических процессов включающих гомеостаз железа, морфогенез, защиту организма от инфекций, воспалительных и раковых заболеваний. Примечательно, что для каждой функции, которой обладает ЛФ, соответствует несколько различных молекулярно-биохимических механизмов, что позволяет этому белку достигать максимальный биологический эффект в организме. Очень перспективными в биофармацевтическом плане считаются активности ЛФ, которые относятся к противовоспалительным и антиканцерными свойствам этого белка. Эти функции ЛФ, скорее всего, определяются каскадом молекулярных сигналов, инициируемых после связывания ЛФ с определенными рецепторами эпителиальных и иммунных клеток. Требуется более детальное изучение этого процесса.

Ряд свойств ЛФ хорошо изучен в in vitro экспериментах, поэтому в настоящее время особенно актуальным становится исследование ЛФ непосредственно в организме, что позволит более детально определить его физиологическую роль и определить возможность использования этого белка как терапевтического агента при инфекциях, воспалительных процессах, и раковых заболеваниях. Наиболее информативным в этом случае, по-видимому, является использование животных с дефектным геном ЛФ, что даст возможность достоверно дифференцировать действие экзогенного ЛФ на организм. Тем не менее, при использовании ЛФ в in vivo экспериментах следует осторожно оценивать полученные результаты, в особенности в опытах с использованием высоких концентраций этого белка, выделенного из чужеродного объекта и с недостаточной гомогенностью.

 

статья взята с сайта НПО Нарвак 

статья и библиография размещены на: 

http://www.narvac.com/art_laktoferrin2.htm

 

Нет учетной записи? Регистрация

Войти в учетную запись